前言 慢性髓系白血病(CML)是一种血液系统的恶性肿瘤，以染色体异常t(9;22)(q34;q11)为特征，通过这种染色体易位激活了一种新的酪氨酸激酶BCR-ABL嵌合蛋白，此蛋白的产生成为此病发病的原因。最近，格列卫去铁胺以BCR-ABL二聚体为作用靶位，在临床应用时患者显示出较高的缓解率。目前患者应用格列卫的固定剂量为400mg/天；但是，对于一些患者来说，他们可以在降低格列卫剂量的同时维持于缓解的状态。在此研究中，我们通过实时定量聚合酶链反应分析法来判定BCR-ABL在CML患者中的转录水平，并且探索格列卫的个体化治疗剂量。35名CML患者中，包括17名新诊断的患者，16名以前用过干扰素治疗的患者及2名异基因干细胞移植后复发的患者。其中，31人达到完全细胞遗传学反应(占患者数的80%)，21人获得主要的分子学反应(MMR, 占患者数的60%)，7人获得了完全分子学反应(CMR, 占患者数的20%)。有2名患者中途退出了试验，其中1名达到MMR但对药物不适应；另一名达到CMR，但是二者分别在用药第7个月与第13个月复发。有7名患者由于副反应的发生而降低了用药剂量，但他们中4人达到了MMR，两人维持CMR超过23个月。这些结果提示：一些患者可以在应用低剂量的格列卫时获得缓解。

 

     介绍  慢性髓细胞血病(CML)是一种致死性的血液系统失调疾病，起因于非常原始的造血干细胞恶性转变。染色体易位t(9;22)(q34;q11)，形成Ph染色体，产生一种新的融合基因BCR-ABL(sawyers 1999),此融合基因表达一种激活的酪氨酸激酶，它可以导致CML的发生(Daley etal.1990;Lugo etal.1990)。CML患者的中位生存期为3-6年，大多数患者死亡是由于疾病从进展期转入加速期。α-干扰素(IFN)可以诱导细胞遗传学反应，患者的中位生存期为5-7年。尽管获得完全细胞遗传学反应(CCyR))患者的10年生存率为70%-85%，IFN诱导的CCyR仅为5%-30%。

 

    格列卫已经成为CML患者治疗的标准药物(kantarjian etal.2002a;Talpaz etal.2002)。格列卫是BCR-ABL酪氨酸激酶活性的选择性抑制剂。此药被认为竞争性地与酪氨酸蛋白三磷酸腺苷结合位点相结合，包括ABL自身及BCR-ABL杂合蛋白(Schindler etal .etal.2000)。国际上对于IFN与 ST571(IRIS)的随机化研究表明：格列卫治疗可以使白血病细胞快速并稳定的减少。经过12个月的治疗，大约使得39%的患者BCR-ABL/ BCR水平下降至少3个log值。

         

    与此对应，应用IFN治疗的患者只有2%达到了上述的水平，体现出格列卫在治疗CML方面的优越性。而且，对于CCyR患者，BCR-ABL/ BCR水平下降至少3个log值的患者在治疗第24个月时100%没有进入进展期，而BCR-ABL/ BCR水平下降小于3个log值的患者在治疗第24个月时95%没有进入进展期；没有达到CCyR的患者在治疗第24个月时85%没有进入进展期(Hughes etal.2003)。一系列的证据表明：格列卫为治疗CML的标准药物，并且通过实时定量PCR(RQ-PCR)检测微小残留病变(MRD)来评价疾病状态是很重要的。

 

   在此研究中，我们利用RQ-PCR法来测量CML处于慢性期经过格列卫治疗的患者BCR-ABL转录水平。基于试验结果，我们确定了获得分子学缓解的可能性以及提出了格列卫个体化治疗的剂量。

 

 

      从2000年10月到2005年8月，35例处于慢性期的CML患者用格列卫进行治疗：17例为新发病例，16例为在慢性期预先经过干扰素治疗的患者，2例为进行异体干细胞移植(SCT)后复发的患者(1例为分子学复发，另1例为细胞遗传学复发)。

 

      慢性期被定义为：在骨髓及外周血中，存在少于15%的原始细胞，少于20%的嗜碱性细胞，原始细胞与早幼粒细胞总数少于30%，血小板数量至少为100，000/立方毫米，并且不伴有髓外疾病(Kantarjian etal.2002a,b;2003)。分子学复发被定义为：(1)在间隔至少1个月的3个连续的时刻，BCR-ABL/ABL比率大于0.02；(2)此比率在两个连续的时刻大于0.05；或者(3)转录数在3个连续的时刻增加伴随最后两个时刻BCR-ABL/ABL比率大于0.02(Olavarria etal.2001.)。

      患者每天应用格列卫的剂量为400mg,剂量根据非血液学及血液学的毒性反应来调节。药物毒性反应及评分(根据国际癌症机构普通的毒性标准 National Cancer Insitute Common Criteria(译本2.0)。在每次的观察中都要进行。根据国际条例，通过口头或书面的形式获得知情同意。

 

     在应用格列卫前及开始应用格列卫治疗后每3-6个月测外周血RQ-PCR水平。反应评价与那些应用格列卫资料发表的研究(Kantarjian etal.2002a;Talpaz etal.2002)相同。完全血液学反应(CHR)被定义为：外周血中白细胞计数小于10，000/μl；血小板计数小于450，000/μl.；中幼粒与晚幼粒细胞小于5%；嗜碱性细胞小于20%，并且所有与白血病相关的症状与体征(包括明显的脾肿大)消失持续至少4周。细胞遗传学反应基于每个骨髓样本中至少20个处于细胞分裂中期Ph的情况，完全反应(0%)，部分反应(1%-35%)，较小反应(36%-65%)，最小反应(66%-95%)，没有反应(95%)。主要细胞遗传学反应(MCyR)被定义为完全或部分反应。主要分子学反应(MMR)被定义为：与格列卫治疗前相比较，BCR-ABL转录水平下降3个log值(Hughes et al.2003)。完全分子学反应(CMR0被定义为通过巢式PCR没有观察到BCR-ABL水平。

 

    细胞遗传学分析通过G带技术进行。骨髓样本经过短期(24小时)的培养后用于检测，至少分析20个细胞分裂中期。外周血BCR-ABL转录水平通过RQ-PCR进行检测。巢式PCR技术用来证实通过RQ-PCR没有检测出的BCR-ABL水平。外周血(7ml)总PCR提取通过胍盐异硫氰酸酯-酸苯酚程序进行,4μg总RNA通过随机六聚物引物反转录成cDNA(Perkin-Elmer,Wellesley,MA,USA)。最后，80μlcDNA溶液保存于-20℃，分析时取出。

BCR-ABL的RQ-PCR引物与探针如下：5′-TCC GCT GAC CAT CAA TAA GGA (根据nt3173-3193)；ABL抗致敏作用,5′-CAC TCA GAC CCT GAG GCT CAA(根据nt277-257)。B3a2与b2a2的TaqMan探针为:CCC TTC AGC GGC CAG TAG CAT CTG A(根据ABL基因的nt230-254)。ABL的引物与探针：ABL 敏感的，5′-TGG AGA TAA CAC TCT AAG CAT AAC TAA AGG(根据nt372-401); ABL抗致敏作用, 5′-GAT GTA GTT GCT TGG GAC CCA(根据nt495-475); ABL的TaqMan探针, 5′-CCA TTT TTG GTT TGG GCT TCA CAC CAT T(根据nt467-440)引物序列与探针由Prof.j.Gabert(Gabert et al.2003)友情提供。探针由6-羧基荧光素标记，5-羧基-四甲基-若丹明作为淬灭荧光，通过Fusion Quant Calbrators(Ipsogen,Marseille,France)。

 

    RQ-PCR通过ABI PRISM 7700 序列分析仪分析(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。50μlPCR反应混合物，包括5μl 10×PCR缓冲液，5mM  Mgcl₂  250μM, dNTP 200nM,引物100nM，探针1.25单位，4μl样品c DNA。PCR扩增以95℃变性10分钟开始，接着为95℃40个循环15秒，并且在58℃延伸60秒。ABL作为对照基因，每个样品BCR-ABL水平通过BCR-ABL与ABL的比率来表示。我们的初步研究表明，利用RQ-PCR可以从10⁵BCR-ABL阴性细胞中检测到1个BCR-ABL阳性细胞。从新诊断的未用过格列卫进行治疗的慢性期CML患者中收集到的20个样本，其中位值作为标准基线。对于每个样本BCR-ABL水平在标准基线以下的评价方法参照Hughes et al.(2003)。

 

     随访的中位时间开始于治疗的第29个月(范围：9-38个月)。研究组的中位年龄为47.8(范围：21-77)。22名患者为男性13名为女性。35名患者中有32名获得CHR。这些患者中包括17名新诊断患者中的16名(94%)，16名在慢性期预先应用干扰素治疗的14名(88%)及2名异体干细胞移植的患者(100%)。所有32名CHR患者获得MCyR 。35名患者中31名达到CCyR (89%)；处于早期慢性阶段17名患者中16名(94%)以及处于晚期慢性阶段的16名患者中13名(81%)达到了CCyR 。3名患者没有反应。尽管我们通过直接的序列分析来评价BCR-ABL激酶关键区突变，但是在3名对格列卫治疗无反应的患者在热点处没有发现突变(数据没有显示)。在格列卫治疗期间没有患者死亡，在治疗期间没有发生基因转变。

 

    在用格列卫治疗前BCR-ABL/ABL的中位检测率为49.43%(范围0.115-289.57%)。因此，在本研究中MMR被限定为至少BCR-ABL/ABL率小于0.049%，下降3个log值。

    35名患者中21名(60%)获得了MMR；早期慢性阶段17名患者中10名(59%)；晚期慢性阶段16名患者中9名(56%)；2名异体干细胞移植的患者(100%)获得了MMR。在21名患者中，16名维持MMR的中位时间为13.5个月(范围为1-36个月)。5名在暂时性的或永久性的治疗中断后失去了MMR。对于治疗中断的原因：4人因为毒性反应，1人因为对药物不适应。5人中3人在恢复使用格列卫后重新获得了MMR，5人中的2人BCR-ABL/ABL率下降了2个log值。35名患者中7名获得了CMR(20%)。早期慢性期17名患者中4名获得了CMR(24%)。晚期慢性期异体干细胞移植2名患者中1名获得了CMR(50%)。

 

     有29名患者观察到了格列卫副作用(83%)，比较常见的有：液体潴留，皮肤疹，恶心，呕吐，肌肉痉挛。在15名患者中观察到3级及3级以上的不良反应(43%)。在6名患者中观察到了3级及3级以上的非血液学不良反应:皮肤疹(17%)。所有的毒性反应通过调整剂量或中断治疗都得到了缓解。在11名患者中观察到了血液学不良反应：中性粒细胞减少(31%)；血小板减少(6%)。7名患者由于不良反应而减少剂量。减少剂量的最常见不良反应为：骨髓抑制，皮肤疹，液体潴留，腹泻。

 

    2名患者终止使用格列卫。1名异基因干细胞移植后患者维持CMR6个月后在分子学水平复发，然后通过巢式PCR证实CMR后终止格列卫治疗。在中断治疗7个月后，患者又产生了分子学复发。格列卫再次应用的剂量为400mg,,经过4个月的治疗后，BCR-ABL水平再次恢复阴性。另1名患者在获得主要分子学反应后，由于对格列卫不适应而中断治疗，在13个月后产生了细胞遗传学复发。

 

    格列卫剂量在7名患者中下调。在格列卫剂量下调后，3名患者BCR-ABL/ABL率升高了2个log值。他们重新应用格列卫的剂量为400mg/天。3名患者中1名重新获得了CMR。其他2名患者稍后BCR-ABL/ABL率下降了2个log值。

 

    另一方面，在4名患者中没有发生分子学复发。由于不良反应的发生，格列卫剂量被调整到小于300mg/天。有趣的是2名患者在交替应用格列卫200mg/天与100mg/天后获得了CMR。在写这篇文章时他们还在应用小剂量的格列卫进行治疗并且仍然处于CMR状态(分别为23个月与29个月)。

1名患者由于分子学反应不理想将格列卫剂量调整到了600mg/天。在剂量加大后，这名患者获得了主要分子学反应(数据没有显示)。

 

     由于在CML早期阶段用格列卫进行治疗的CCyR率为75%-90%，但是对于评价此疾病状态的常染色体分析敏感性不令人满意。最近，RQ-PCR以BCR-ABL为作用靶位被作为常规检测CML患者MRD的方法，此过程与ALL患者 Ph+相似(Yamada et al .2004)。

 

     通过RQ-PCR来定义MMR备受争议.Hughes et al.2003定义了BCR-ABL/ABL率下降3个)log值与进展期存活率相关；但是对于BCR-ABL/ABL率已经下降的患者来说则无实际意义。另一个判定标准为BCR-ABL/ABL率小于0.05%。此标准基于以前的研究：BCR-ABL/ABL率在0.045-0.1%之间具有重要的诊断意义(Huchhaus et al.2000;Paschka et al.2003)。根据这些标准，MMR达到39%-62%，并且4%-38%的患者达到了未检测到BCR-ABL的水平。在本研究中在用格列卫治疗获得CCyR的32名患者中，21名获得了MMR(60%)，7名获得了CMR(20%)。处于早期慢性期的患者与晚期慢性期的患者相比较，容易对治疗产生较好反应。但是在后续治疗中二者没有明显的区别。Cortes et al(2005)报道了77%的患者维持在MMR状态，几乎半数的患者达到了CMR。全面地讲，我们的数据来自于小样本(n=35)，但是他们的数据与出版物的报道相一致。

 

     最近，格列卫以400mg/天的剂量应用于所有的患者。一些患者可能不用全量的格列卫即可维持缓解；但是，对于格列卫治疗患者获得细胞遗传学反应与分子学反后，治疗是否可被安全的中断还不清楚。以我们所知，有其它报道表明11例格列卫治疗中断的患者是由于毒性反应或患者自己的要求：9例未检测到BCR-ABL转录水平。总的来讲，在7例患者中，格列卫中断治疗后在第3-10个月又重新达到分子学与细胞遗传学反应。因此，11例患者中7例在停用格列卫之后复发。在没有用格列卫治疗的患者中，有3名CMR的患者维持13-15个月；1名MCR的患者维持18个月后复发。在本研究中，2名患者中断使用格列卫。在中断使用格列卫的过程中，有1名患者已经维持CMR18个月，另1名患者已经维持MMR3个月。这两名患者在停药第7个月与第13个月时均复发 。Cortes et al. (2004)建议：不推荐在患者使用格列卫获得分子学反应时进行中断治疗。Bhatia et al.(2003)提出BCR-ABL阳性造血细胞始动因子存在于CCyR患者的骨髓中，提示：经过格列卫治疗的患者CML始动因子受到抑制但没有被消除。从目前的情况看，因为大部分患者停用格列卫后复发，所以，即使达到CMR的患者也不要停止格列卫治疗，提示我们：即使即使检测不到BCR-ABL转录的水平也不意味已经治愈。但是，几个保持分子学反应的患者暗示对某些患者来说，终止格列卫治疗是可能的。

 

    考虑到剂量调整的情况，在本研究中，我们使用推荐的剂量。在7名患者中，我们应用降低剂量的格列卫进行治疗。3名患者发生分子学复发，4名患者在不提高BCR-ABL的情况下维持于MMR。另外，4名未发生分子学复发的患者由于不良反应将格列卫的剂量降至300mg/天。尽管我们对患者的随访时间短，但4名患者中有2名在应用低剂量格列卫治疗时仍然维持CMR超过13个月。这些结果表明，降低格列卫的用药剂量而不是中断其治疗在部分CMR患者中是可以接受的。需要强调的是MRD检测是必要的，因为CML细胞可能在使用低剂量格列卫时产生抗药性(Yoshida and Melo 2004)。

 

    总结一下，我们的结果表明：一些达到MMR的CML患者可以应用低剂量的格列卫进行治疗，因此可以降低治疗的成本。更进一步，具有探索性及可比较性的研究对于建立降格列卫用药的安全剂量是很关键的。