王凯综述 吴世凯 宋三泰审校
北京 100071 军事医学科学院附属医院乳腺癌科
应用肿瘤原代细胞药敏实验指导临床化疗方案的设计，一直是临床肿瘤医生渴望得到的重要技术。但在过去的几十年间，虽然人们对此进行了广泛地探讨，但美国临床肿瘤学会技术专家组的最新评估认为，目前已有的各种肿瘤原代细胞体外药敏实验方法，均存在与临床疗效符合率低等缺点，因此还不宜推荐广泛临床应用。但考虑到肿瘤原代细胞药敏实验潜在的重要临床价值，因此鼓励进行新的肿瘤细胞药敏技术创新〔1〕。本文将对该领域的研究现状和发展趋向进行综述探讨。
一、理想的肿瘤原代细胞药敏实验体系
理想的肿瘤原代细胞药敏体系的目标是筛选对肿瘤患者敏感的高疗效药物，避免传统化疗方案设计的盲目性，从而降低无效药物对患者身体损害的风险，提高药物治疗指数，降低医疗花费。具体在技术层面上应该满足如下条件：(1)需要的肿瘤组织较少，不影响其他病理检查对肿瘤标本的需求；(2)可完成多种化疗药物、至少6个药物浓度的药敏评价。(3)实验结果成功评价率高于90％；(4)具有较好的结果重复性；(5)体外实验结果与药物体内疗效有较好的符合率。为了建立上述理想的药敏体系，人们对此进行了长期的实验探讨。下面将对各种常用的体外药敏实验方法进行简介和对比分析。
二、肿瘤原代细胞体外药敏实验的常用方法
1. 克隆形成实验(HTCA) HCTA法是在含有化疗药物的培养条件下，观察细胞分裂、克隆形成的一种方法。Von Hoff等较早开展了这方面的研究。结果发现该方法的评价成功率为45-64%，实验指导化疗方案治疗转移癌的有效率为25%，而同期经验选择方案的有效率为14%〔2〕〔3〕。此种方法由于需要活细胞的数量较大、培养要求高、克隆形成率较低，现已很少使用。
2. 肾包膜下移植法(SRCA) SRCA法是在裸鼠肾胞膜下接种人类肿瘤组织，肿瘤形成后进行化疗药物实验，选择有效化疗药物。Maenpaa等进行了该方法进行卵巢癌化疗方案筛选的前瞻性对照研究。结果显示该技术评价成功率为70%，筛选化疗方案的有效率为62%，对照组经验方案的有效率为59%，两组间未见生存率差异〔4〕。由于该方法在裸鼠体内复制人类肿瘤，操作过程复杂，消耗小鼠量很大。同时由于瘤体的接种成功率较低，明显影响此方法的临床推广应用。
3．差别染色细胞毒检测法(DiSC)DiSC法是将肿瘤细胞直接浸入化疗药物中，然后再采用快绿/苯胺黑进行染色，由于不能排出染料的细胞是死细胞，通过在显微镜下计算被杀死的肿瘤细胞比率，反应化疗药物的效果。该方法不需要单细胞悬液，不依赖细胞的分裂。Gazdar、Wilbur等进行了该方面的研究，结果显示该技术评价成功率为33-78%〔5〕〔6〕，但疗效结果的差异较大。该方法需要具有丰富的细胞学经验，易受人为因素影响，目前还缺乏随机对照研究的评价。
4. 甲基噻唑基四唑(MTT)药敏实验 MTT方法是利用细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将MTT分子分解，产生颜色反应的原理，通过体外细胞培养中的线粒体琥珀酸脱氢酶的活力测定，来判断肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。我国学者徐建明较早进行了该方面的研究。非随机的结果显示该方法评价成功率为88%，药敏指导化疗方案的临床有效率为77%〔7〕。该方法由于需要细胞数量较大，实验结果受酶标仪检测条件、肿瘤细胞的代谢和PH值的影响，检测结果与临床疗效符合率不高，不少学者在探讨对此技术的改良。
5. 三磷酸腺苷(ATP)检测方法 该方法通过检测生物代谢所必须的ATP水平，来评价药物对肿瘤细胞的杀伤效果。Kurbacher等进行了该方法的非随机对照研究。结果显示该方法进行卵巢癌化疗方案筛选的评价成功率为93%，实验指导化疗方案的临床有效率为64%〔8〕,而经验选择方案有效率为37%。但该研究结果引起不少质疑，因为药敏实验组25例患者中，23例接受了联合化疗，并且12例接受了紫杉类，而经验选择方案组30例患者中，21例接受联合化疗，没有患者接受紫杉类化疗。尽管该实验方法已引起人们较大的关注，但也同样存在着肿瘤原代细胞培养困难，间质细胞干扰较大等缺点。实验结果的重复性和稳定性还需要进一步探讨。
三、非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠(NOD/SCID鼠)平台上的原代药敏实验
1. NOD/SCID鼠移植瘤模型的建立
鉴于传统肿瘤原代细胞存在的肿瘤细胞培养存活率低、检测方法多为间接检测、检测结果与临床符合率较低等诸多缺点。近年一种新型免疫缺陷鼠NOD/SCID鼠的出现，使建立理想的肿瘤原代药敏实验体系成为可能。NOD/SCID鼠于1995年由Shultz LD建立〔9〕〔10〕。该品系鼠为非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠，不但成熟T、B细胞联合免疫缺陷，而且单核巨噬细胞、NK细胞功能下降，补体系统不健全，因此该鼠对异种细胞排斥性较弱，人类原代肿瘤很容易在其体内成瘤。鉴于此，不少学者尝试在该品系鼠体内建立恶性肿瘤原代细胞模型的可行性。Beckhove等较早探讨了人类乳癌组织在NOD/SCID鼠体内成瘤的可行性[11]。共采集了61例乳腺癌患者的原发乳癌标本，植入NOD/SCID鼠后腿肌肉间，NOD/SCID鼠分为全身照射组和未照射组。结果发现移植后3天，植入肿瘤开始形成新生血管，逐渐生长成瘤后，移植瘤保持了原始肿瘤组织的组织学形态、相同的肿瘤标记物，并且这种移植瘤可在NOD/SCID鼠体内传代生长。研究还发现成瘤率两组间无差别，但被照射组的NOD/SCID鼠死亡率较高。本研究初步显示这种新型异种移植瘤模型可用于抗癌治疗的实验研究。其他学者也在NOD/SCID鼠体内成功地建立了人类原代多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征模型，为评价上述疾病的治疗手段提供了较好的平台。
2. NOD/SCID鼠体内人类肿瘤原代细胞药敏实验
随着NOD/SCID鼠体内建立原代肿瘤模型技术的稳定和成熟，不少学者开始探讨在NOD/SCID鼠体内进行化疗药物药敏实验的可行性。Fichtner等〔12〕较早在建立的人类白血病NOD/SCID鼠模型体内，进行了肿瘤放化疗耐药性和敏感性的评价分析。新近Liem NM等更是应用NOD/SCID鼠建立了儿童急性淋巴细胞白血病体内模型，并进行了体内药物敏感性评价〔13〕。该研究共10例患儿入组，进行了MTX、VCR、地塞米松三种药物的敏感实验，并且根据实验结果进行全身化疗方案选择。结果发现5例死亡，中位生存期为13(范围11-76)个月；5例存活，中位生存期为103(范围56-131)个月。进一步分层分析显示药敏实验对VCR、地塞米松敏感与不敏感患者间存在显著生存差异(p=0.028、p=0.029)，同时深入分析还发现，对地塞米松敏感与否与患者的临床疗效和生存期存在显著的相关性。该研究第一次证明了人类儿童ALL可在动物体内重建，并可准确反应肿瘤的临床特点，在NOD/SCID鼠体内进行的药敏实验结果，可预测临床药物的疗效。该研究结果强烈推荐NOD/SCID鼠作为肿瘤治疗方法的评价模型，筛选和指导临床治疗方案的选择。
四、应用NOD/SCID鼠建立药物敏感实验模型的前景
综上所述，应用NOD/SCID鼠建立常见恶性肿瘤的原代肿瘤模型，并进行体内化疗药物敏感实验，以指导恶性肿瘤的临床化疗方案的设计，有可能实现应用药敏实验指导化疗方案设计的新突破。而这种研究平台，不但可用于抗肿瘤化疗药物的敏感性评价，还可以进行放疗、内分泌治疗、免疫治疗、分子靶向治疗等新治疗手段的评价。
参考文献
1. Schrag D, Garewal H S, Burstein H J, et al. American society of clinical oncology technology assessment: chemotherapy sensitivity and resistance assays. J Clin Oncol 2004; 22: 3631-3638.
2. Von Hoff DD, Clark GM, Stogdill BJ, et al. Prospective clinical trial of a human tumor cloning system. Cancer Res 1983; 43:1926-1931.
3. Von Hoff DD, Kronmal R, Salmon SE, et al. A Southwest Oncology Group study on the use of a human tumor cloning assay for predicting response in patients with ovarian cancer. Cancer 1991;67:20-27.
4. Maenpaa JU,Heinonen E, Hinkka SM, et al. The subrenal capsule assay in selecting chemotherapy for ovarian cancer: A prospective randomized trial. Gynecol Oncol 1995;57:294-298.
5. Gazdar AF, Steinberg SM, Russell EK, et al. Correlation of in vitro drug-sensitivity testing results with response to chemotherapy and survival in extensive-stage small cell lung cancer: A prospective clinical trial. J Natl Cancer Inst 1990;82:117-124.
6. Wibur DW, Camacho ES, Hiliard DA, et al. Chemotherapy of non-small cell lung carcinoma guided by an in vitro drug resistance assay measuring total tumor cell kill. Br J Cancer 1992;65:27-32.
7. Xu JM, Song ST, Tang ZM, et al. Predictive chemotherapy of advanced breast cancer directed by MTT assay in vitro. Breast Cancer Res Treat 1999;53:77-85.
8. Kurbacher CM, Cree IA, Bruckner HW, et al. Use of an ex vivo ATP luminescence assay to direct chemotherapy for recurrent ovarian cancer.
9. Schultz LD, Schweitzer PA, Christianson SW, et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J Immunol 1995;154:180 –91.
10. Garofalo A, Chirivi RGS, Scanziani E, Mayo JG, Vecchi A, Giavazzi P. A comparative study on the metastatic behavior of human tumors in nude, beige/nude/xid and severe combined immunodeficient mice.Invasion Metastasis 1993;13:82–91.
11. Beckhove P, Schutz F, Diel IJ,et al. Efficient engraftment of human primary breast cancer transplants in nonconditioned NOD/Scid mice. Int J Cancer. 2003; 105(4):444-53.
12. Fichtner I, Paal K. Chemo- and radiation sensitivity of xenografted acute lymphob lastic leukemias- correlation to the expression of multidrug resistance proteins. Anticancer RES. 2003; 23(3B): 2657- 64.
13. Liem NL, Papa RA, Milross CG, et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of ew therapies. Blood. 2004; 103(10): 3905-14.
