肺部肿瘤的抑癌基因治疗

      一、抑癌基因简介

      抑癌基因(tumor suppressor gene )又称抗癌基因(antioncogene )、肿瘤易感基因(tumor susceptibility gene)、隐性癌基因(recesive oncogene)。最早是由Knudson提出的，指正常细胞内存在的能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。目前已分离克隆的抑癌基因有很多，包括Rb，WTp53，ERBA，WT1，NF1，DCC，MCC，APC，nm23，TIMP，MTS等。正常细胞增殖的调控信号大体上可分为促使细胞进入增殖周期并阻止其发生分化的正信号及抑制细胞进入增殖周期并促进其发生分化的负信号两类。细胞内存在的癌基因和抑癌基因对细胞的生长发育和终止分化就起着这样的正负调控的作用。但某种癌基因或抑癌基因只有针对某种特定的组织或细胞才有意义，即各种组织来源的恶性肿瘤应有它特定的癌基因及抑癌基因谱；不同组织来源的肿瘤有其相同的基因群。抑癌基因可因点突变、DNA片段缺失、移位突变等原因而失活，失活的抑癌基因使癌基因能发挥其作用而导致细胞持续增长，癌基因的激活和抑癌基因的失活 最终使细胞的生长和分化调节失控，导致细胞持续分裂而癌变。

 

      二、抑癌基因的功能

      抑癌基因及其产物的生物学特性及功能目前还不十分清楚。Sarger推测抑癌基因的编码产物包括很多抑制细胞生长的物质，其中有抑素、生长抑制因子以及维持基因遗传稳定性的物质。抑癌基因及其编码产物的功能可概括为以下几方面：

 

      (一)稳定染色体

      恶性肿瘤常伴有染色体的畸变或异常。研究表明。这常与癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关。在许多肿瘤细胞中可观察到典型的胞嘧啶甲基化的降低，这也许正是抑癌基因功能丧失的直接结果。此外，调节DNA修复的基因可能也属于抑癌基因的范畴。

 

      (二)调节细胞分化

      分化是典型的肿瘤抑制模式，因为极端分化的细胞失去了分裂的能力。体细胞杂交试验形成的N×X杂合子只表示正常细胞的分化性状而未表现肿瘤细胞的特征，这一现象提示在正常亲本细胞中抑癌基因如p53基因等的表达也许与其分化途径相关，甚至就是分化途径中的一部分。

 

      (三)控制细胞增殖

      抑癌基因的主要作用就是抑制细胞增殖，已克隆出的两个抑癌基因Rb及WTp53就具有控制细胞增殖的功能，如Rb的蛋白产物具有DNA结合能力，这在所有的脊椎动物中均可测到。

 

       (四)其它

      每一种抑癌基因及其产物均有其特殊的功能，如DCC基因能编码一种同细胞粘附分子以及相关的细胞表面糖蛋白具有明显同源性的蛋白。因此DCC基因的缺失可能会改变正常的细胞与细胞间或细胞与细胞外间质之间的相互作用，引起细胞间粘附力以及伴随着这种粘附力的生长阻抑信号发生改变，这与肿瘤的发生发展尤其是肿瘤的转移有重要的关系。

 

      除以上功能外，抑癌基因尚有触发衰老、诱导细胞程序性死亡、抑制蛋白酶活性、诱变DNA甲基化酶活性、调节组织相容性抗原、调节血管生成等作用。

 

      三、抑癌基因疗法的应用

      抑癌基因一经发现，即引起了广大研究者的注意和重视，尤其是1989年发现了p53基因的突变是某些恶性肿瘤发生的主要原因后，抑癌基因的研究成为肿瘤基因治疗领域研究的热点。p53抑癌基因在人类各种肿瘤中突变率很高，而且突变后即由抑癌基因变为癌基因，并具有恶性转化作用。在肺部肿瘤患者中有50%左右存在着p53基因的突变，在非小细胞肺癌中突变率更高。基因治疗的基本策略是以正常的野生型p53基因替换肿瘤细胞中突变的p53基因，即利用基因转染法将野生型p53基因转染肿瘤细胞。Fujiwara等用携带野生型p53基因的逆转录病毒载体在体外转染人非小细胞肺癌细胞系H226Br，转染后的肿瘤细胞在体外的生长明显受到抑制，而后进一步观察了体内转染基因的治疗效果，将2×106的H226Br细胞经气管穿刺接种于辐射后的裸鼠的肺部，3天后开始治疗，以同样的方法接种携带野生型p53基因的逆转录病毒载体，空白对照载体和病毒稀释液为对照。在肿瘤细胞接种30天后，观察到用携带野生型p53基因的逆转录病毒治疗的小鼠肿瘤发生率为0%-30%，其他各组62%-80%，如果携带野生型p53基因的逆转录病毒载体与空白病毒混合后治疗小鼠。其抑瘤效率明显降低。过去常采用逆转录病毒作为基因转染的载体，由于它存在只转染分裂期细胞的缺点，疗效受到一定限制，腺病毒可以转染非分裂细胞，再加上它与呼吸道上皮细胞有天然的亲和力，所以腺病毒转染效率较高。为了提高基因的转染效率，Zhang等构建了携带野生型p53基因的重组腺病毒载体Ad5CMV-p53。非小细胞肺癌细胞系H358的p53等位基因完全缺失，用Ad5CMV-p53以30-50PFU/细胞转染时转染率的达95%~100%，用Westernblot方法测得高水平表达的p53蛋白，H358细胞体外生长明显受抑(72%~79%)，而用Ad5CMV-p53转染野生型p53基因未完全缺失的肿瘤细胞系时，抑制生长的效率明显不如前者(28%)；进一步研究发现，在高转染率时，通过p53基因表达途径诱导细胞发生凋亡而抑制生长，而在低转染率时，细胞未发生凋亡，但用射线或药物处理后，细胞又发生凋亡而生长受抑。Fujiwara等用腺病毒Ad5CMV-p53治疗前述的肺癌模型，2×106的H226Br细胞经气管接种至小鼠肺部，3天后开始治疗，气管内滴注病毒，每只小鼠5×107 PFU，每日一次，连用2天，设空白病毒、病毒稀释液为对照，6周后观察效果，用Ad5CMV-p53治疗的小鼠只有25%发生了肿瘤，而在另两个对照组中，70%-80%的小鼠发生了肿瘤，Ad5CMV-p53治疗组中小鼠所发生的肿瘤的体积亦明显小于对照组小鼠所发生的肿瘤的体积。这些研究表明，逆转录病毒和腺病毒载体在体内可以有效地携带p53基因，单一的抑癌基因的置换即能有效地抑制肺癌的发生和生长。1994年，美国重组DNA咨询委员会(RAC)批准了Texas大学Anderson癌症中心的 Roth等进行非小细胞肺癌的以腺病毒介导的p53基因治疗的临床试验，Roth等通过逆转录病毒载体，将野生型p53基因导入9例用常规治疗无效的NSCLC患者，治疗后5个月，取肿瘤活检组织作原位杂交和DNA多聚酶链反应检测，局部仍有载体和p53基因序列。与治疗前组织标本相比，治疗后肿瘤组织中细胞凋亡的发生率明显增加。3例患者肿瘤组织缩小，3例患者肿瘤组织未扩大。未发现有载体相关毒性。由于重组的病毒载体对人将产生什么样的毒副作用尚不完全清楚，尤其是病毒载体有引起肺炎的潜在危险性，临床试验仅限于病灶局限的病例，而不能用于那些癌症已扩散至胸膜腔的病例。Nguyen等用携带p53基因的腺病毒，经支气管镜局部滴入，同时给予顺铂化疗。结果肿瘤细胞的生长明显受抑，凋亡细胞数增加。汪蕙等采用基因枪介导外源野生型p53基因，建立人肺巨细胞癌系801-D的转染细胞系801-D-p53，结果表明，转染细胞系801-D-p53体外长期传代有外源 p53基因存在，转染细胞生长明显受到抑制，裸鼠异种移植致瘤性降低，肿瘤生长明显缓慢。这是国内首次成功地运用基因枪转移外源p53基因到人肺癌细胞。

 

       MTS1(p16)是人类第一个最直接抑制肿瘤发生的细胞固有成分。Shimizu等应用PCR-SSCP方法检测30例原发性肺癌标本，其杂合性丢失发生率为50%，突变率占7%，说明在某些原发性肺癌的发生发展中MTS1起一定作用。Jin等进行了有益的探索，他们将携带野生型p16的腺病毒导入p16表达阴性的肺癌细胞系中，结果发现p16的表达阻止了细胞由G1期进入S期，且抑制了体外与体内肿瘤的增长。这一发现表明可以利用p16做基因置换治疗。

 

      肺部肿瘤的反义基因治疗

 

      一、反义基因治疗概述

      反义基因治疗就是基因封闭或基因灭活，即用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，以期阻断瘤细胞内的异常信号传导，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡。

 

      反义核酸包括三类：一类是将特异的反义基因连到特定的表达载体上(质粒、病毒)，导入靶细胞直接转录出反义RNA，与相应的mRNA形成双链，阻止mRNA的翻译过程。另一种类型的反义核酸是人工合成的寡脱氧核苷酸，进入机体后以胞吞的方式进入细胞与相应的mRNA结合发挥作用。第三种类型是核糖酶，是一种具有催化活性的反义核酸，其与相应的mRNA结合后能发挥酶活性将mRNA降解。反义基因治疗分为反义DNA治疗和反义RNA治疗。反义DNA治疗是指短链DNA可插入细胞内DNA双螺旋，形成三螺旋结构，阻碍mRNA的转录；或短链DNA与突变靶基因的mRNA相互补，形成RNA-DNA复合体，使突变基因的表达受到抑制。反义RNA是指用一类反义RNA影响mRNA的加工成熟或直接与与mRNA结合而抑制癌基因蛋白产物的生成。

 

      二、反义基因疗法的应用

      癌基因与肿瘤的发生密切相关，分为病毒癌基因和细胞转化基因两类，它们都能使正常细胞转化为肿瘤细胞。此外，人体正常细胞内还存在着原癌基因这样一类正常基因，在细胞中起着调控细胞生长和分化的作用，当这种原癌基因在某些因素作用下，发生数量和结构上的变化时，就形成了致癌性的细胞转化基因，从而使正常细胞转化为肿瘤细胞。反义RNA天然存在于各种细胞中，在细胞的生物进程中起调节作用，人工合成的癌基因的反义RNA在细胞中表达后，能以同样的方式调节细胞内癌基因的表达。反义基因治疗包括反义癌基因治疗，反义多耐药基因治疗，反义免疫抑制因子基因治疗。

 

      1.反义癌基因治疗：许多学者用反义基因抑制癌基因的表达来研究对肿瘤生物性的影响，已取得可喜的实验结果。Amini等首先将表达src反义RNA的表达质粒导入表达v-src基因的src转化细胞，使这种细胞在裸鼠体内致瘤性下降。由此看来，直接针对癌基因进行反义治疗可能会是一条行之有效的治疗途径。Mukhopadhyay等将一个包含2、3外显子及其间内含子的2 kb长的k-ras基因片段，即反义k-ras RNA 的模板构建于一个质粒中，以此质粒转染一株人非小细胞肺癌细胞系H460a，该细胞的k-ras基因在第61密码子出发生了等位突变，导致了突变的k-ras基因的大量表达，转染了反义k-ras基因片段的H460a细胞内突变的k-ras mRNA表达被特异地抑制，突变ras的P21蛋白合成减少，转染后的H460a细胞生长减缓了2/3，在裸鼠体内的致瘤性则明显降低。为了使反义k-ras RNA的模板DNA能更有效地进入细胞，Zhang等构建了包含β-acting启动子，2kb的反义K-ras基因片段，SV40多聚腺苷酸信号的重组逆转录病毒，选用双亲和性的包装细胞系GP+envAm12包装，而后轮流在ψ-2细胞和GP+envAm12中转染，能制备到9×107 CFU/ml的滴度，对H460a转染5~7次后转染率可达95%，经PCR技术和Southern blot分析证实稳定地转染了反义k-ras RNA的基因片段的细胞克隆仍能存活，但生长能力只有未转染的肺癌细胞的10%，在软琼脂内的集落形成能力明显下降，反转录PCR证实有反义k-ras RNA的表达，突变的k-ras蛋白合成特异地受到抑制。Georges等又进一步进行了体内实验，观察这一重组逆转录病毒载体在小鼠肺癌模型上的治疗作用，第一天给350cGy照射后的裸鼠经气管接种1×105 的人非小细胞肺癌细胞H460a，而后在第4，5，6天给小鼠每日一次经气管滴注5×105PFU的重组逆转录病毒，设空白病毒载体及病毒稀释液为对照，30天左右观察结果，用携带反义K-ras基因的逆转录病毒治疗的小鼠中，86%~90%的小鼠不发生肿瘤，在两个对照组中，73%~100%的小鼠发生了肿瘤，并且治疗组小鼠所发生的肿瘤体积明显大于对照组发生的肿瘤的体积。

 

      2.反义多耐药基因治疗：肺癌产生耐药性的主要原因是多耐药基因(MDR-1)表达增强及其编码产物P-糖蛋白(Pgp)增多，Pgp 具有药物泵的作用，把进入细胞内的药物运到细胞外，肿瘤细胞因而耐药。因此，逆转耐药基因是成功治疗肺癌的关键。用构建反义MDR-1重组逆转录病毒载体，转染肺腺癌细胞后发现肿瘤细胞内MDR-1mRNA的表达受到抑制，Pgp表达明显下降，肿瘤细胞对化疗药物的敏感性增强。除了MDR-1基因外，多耐药相关蛋白基因(MRP)在肿瘤耐药中也起重要作用。反义MRP RNA和反义MDR-1 RNA共同转染的肺腺癌细胞耐药性下降了90%。另外，野生型p53基因除了有肿瘤生长抑制和诱导细胞凋亡作用外，还可以增加药物敏感性，而突变型p53基因与肿瘤耐药性密切相关。因此可以用反义突变型p53基因转染肺癌细胞，进行反义基因治疗，以增强对化疗药物的敏感性。

 

      3.反义转化生长因子β(TGT-β)基因治疗：该方法同时也是一种免疫基因治疗，通过转染反义核酸可抑制免疫抑制因子TGT-β的产生，因而增强机体的免疫力。

 

      由此可见，反义基因治疗具有高特异性及较短的外源基因可封闭较大信息量的突变基因等特点，成为较为合理的治疗方法，有很好地应用和开发前景。

 

      肺部肿瘤的免疫基因治疗

 

      一、免疫基因治疗概述

      免疫基因治疗即采用一定的方法或载体将目的基因导入肿瘤细胞或效应细胞-肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，然后将表达目的基因的受体细胞输入患者体内，通过提高人体免疫系统对肿瘤细胞的识别、抑制或杀伤能力从而对肿瘤进行治疗的一种方法。治疗途径可以通过直接转染肿瘤细胞制成瘤苗，也可以通过转染效应细胞来增强效应细胞的抗肿瘤能力。

 

      1.转染肺癌细胞的免疫基因治疗：免疫基因治疗的治疗基因是免疫效应分子，其中研究最多的是细胞因子和共刺激分子，这些基因在肿瘤的局部表达，可以提高肿瘤的免疫原性，激发和增强机体的抗肿瘤免疫反应。

 

      随着生物高技术的发展，人们已经制备纯化出了多种可供临床大量应用的基因工程细胞因子，但是大量的临床试用资料表明，需要给肿瘤患者反复多次注射高剂量细胞因子方能取得一定疗效且患者往往表现出严重的副作用。细胞因子基因治疗在一定程度上克服了以往细胞因子注射疗法需反复多次应用、副作用严重等缺点，也取得了细胞因子注射疗法不具备的疗效。依据将细胞因子及其受体基因导入体内的途径和原理不同，将肿瘤的细胞因子基因治疗分为5种类型。一是免疫效应细胞介导的细胞因子基因治疗。其主要原理是以过继性免疫疗法为基础，即将细胞因子基因导入抗肿瘤免疫效应细胞中，使之抗肿瘤作用增强，并以免疫效应细胞为载体细胞，将细胞因子携带至体内靶部位，使细胞因子局部浓度提高，从而更有效地激活肿瘤局部及周围的抗肿瘤免疫功能。目前可用于肿瘤治疗的免疫效应细胞主要有TIL，LAK，CTL，巨噬细胞。二是肿瘤细胞靶向的细胞因子基因治疗。1989年人们第一次将细胞因子(IL-4)基因转入肿瘤细胞中观察了其体内生物学活性并于1990年首次提出肿瘤细胞靶向的细胞因子基因治疗概念。其原理是以主动性免疫治疗为基础，即将细胞因子基因转染入肿瘤细胞中，制备出免疫原性更强的新型瘤苗，以激发机体产生显著的抗肿瘤免疫功能从而达到治疗肿瘤的目的。经过近年来的研究，人们几乎已将所有与抗肿瘤有关的细胞因子基因转染入肿瘤细胞，发现IL-1，2，3，4，5，6，7，8，10，12，G-CSF，M-CSF，GM-CSF，IFN-γ，IFN-α，TNF-α等基因转染的肿瘤细胞体内免疫后均能诱导出一定程度的抗肿瘤免疫效应。但此诱导作用的强度依不同类型的细胞因子基因转染而有所不同，涉及到的效应细胞的种类亦有所不同。从作用机制上来看，细胞因子基因转染的肿瘤细胞体内接种后，在肿瘤局部产生较高浓度的细胞因子并可持续较长时间，而血循环中的细胞因子水平较低；同时，细胞因子(尤其是炎性细胞因子)基因转染肿瘤细胞接种部位往往有大量炎性细胞浸润，这些炎性细胞可与免疫效应细胞联合发挥抗肿瘤作用。Hunt等将IL-4基因转染人非小细胞肺癌组织的原代培养的肿瘤细胞后，观察转染了IL-4基因的肿瘤细胞对外周血淋巴细胞的增殖能力的影响，结果经转染了IL-4基因的肿瘤细胞刺激的外周血淋巴细胞的增殖能力是用灭活的外周血淋巴细胞刺激的外周血淋巴细胞增殖能力的7.5倍，是用未转染IL-4基因的肿瘤细胞刺激的外周血淋巴细胞增殖能力的4.1倍。Porgador等则研究了转染细胞因子基因对肺癌细胞转移能力的影响。Allison22，免疫原性弱，能在同系小鼠发生自发性肺转移。给D122分别转染了IL-2、IL-6和IFN-γ后观察其致瘤性、自发转移能力和血行性肺转移能力，转染了IL-2、和IFN-γ的D122细胞致瘤性消失，转染了IL-6的D122细胞致瘤性和自发转移能力明显低于转染对照基因(NEO)和不转染基因的D122细胞，在实验性肺转移模型中，转染了IL-6和IFN-γ的D122细胞转移能力明显下降，而在转染IL-2的D122细胞中只有那些能高水平分泌IL-2的克隆株显示出转移能力下降，如果给D122细胞转染H-2Kb的基因，其自发的及血行性的肺转移能力均明显下降。进一步观察瘤苗的免疫学机制，发现转染了IL-2、IL-6和IFN-γ的D122细胞接种后能在小鼠体内诱导出较强的ＣＤ8+Ｔ细胞和ＮＫ细胞获悉功能，而对ＣＤ４＋Ｔ细胞活性则无明显作用，用基因转染的瘤苗来治疗野生型D122细胞的微小转移灶，结果转染了IL-2和IL-6的D122细胞制成的瘤苗无治疗作用，只有高水平分泌IFN-γ的D122细胞灭活后能有效地治疗转移病灶。三是成纤维细胞等载体细胞介导的细胞因子基因治疗。实际上是利用成纤维细胞、内皮细胞、骨髓细胞等这类易于获取和培养、生命周期较长的载体细胞，通过基因转染后将细胞因子基因携带至体内并有效表达，使细胞因子在体内持续性产生并维持较长时间，以充分发挥治疗作用。成纤维细胞介导的IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，G-CSF，IFN-α基因疗法能显著增强机体免疫功能，促进化疗后造血损伤的恢复，配合化疗或骨髓移植或过继性免疫治疗均取得了更佳的抗肿瘤效果。有的学者观察到GM-CSF基因转染的骨髓细胞回输小鼠后能保护小鼠接受高剂量化疗并能促进其造血功能的恢复。四是直接体内途径的细胞因子基因治疗。采取注射的方法直接将细胞因子基因导入体内并使之表达以发挥治疗作用。具体途径有多种。Xing等在证明了腹腔内注射携带IL-6基因的重组腺病毒载体(Ad5-IL-6)可使小鼠体内高度表达IL-6之后，给每只大鼠气管内灌注2×108pfu Ad5-IL-6，发现7天内大鼠肺支气管上皮细胞可高效表达IL-6，从支气管肺泡灌洗液中检测出高水平IL-6，所表达的IL-6局限于肺部，诱导炎性细胞大量浸润，从而提示腺病毒介导的直接体内途径的细胞因子基因治疗可在注射局部诱发相应的免疫和炎性反应。五是肿瘤细胞靶向的细胞因子受体基因治疗。实际上是增加靶细胞对细胞因子作用敏感性的方法。细胞因子发挥生物学作用需先与靶细胞表面受体结合，如果靶细胞表面细胞因子受体表达水平太低，细胞因子与之作用较困难，特别是对于那些对肿瘤靶细胞有直接生长抑制或杀伤作用的细胞因子，若能通过细胞因子受体基因转染的方法，使肿瘤靶细胞表面相应的细胞因子受体表达增多，将大大增强细胞因子抗肿瘤效果。

 

      在细胞因子基因治疗突飞猛进的同时，共刺激分子基因治疗的研究也引起了人们的重视。长期以来对肿瘤免疫的研究表明，机体对肿瘤细胞的免疫排斥主要依赖于体内的T细胞，尤其是CD8+的CTL和CD4+的Th细胞。T细胞在体内抗肿瘤作用的激活需要两类信号：一类是传统的特异的抗原提呈信号；另一类是非抗原特异的、非MHC限制的共刺激信号。缺乏了共刺激信号，体内的T细胞将不可能对肿瘤抗原产生有效的反应进而出现免疫耐受，机体也就易于形成肿瘤。介导这一共刺激作用的分子有很多种，其中最具代表性、最引人注目的也最重要的是B7分子。B7抗原主要包括三类分子：B7-1，B7-2及B7-3，尽管表达B7-1及B7-2的基因不同，这两类共刺激分子却均具有两类天然配体CD28及CTL-4。共刺激分子基因研究的设想是在缺乏共刺激信号的肿瘤细胞中导入共刺激分子基因使之有效表达，进而诱导体内的T细胞产生强大的抗肿瘤免疫反应。共刺激分子在肿瘤细胞上的表达对于体内T细胞的激活具有十分重要的作用。Hellstrom等通过免疫组化法的检测表明，多种人类恶性肿瘤均不能与B7-1或B7-2特异的单克隆抗体结合；Hershey等发现仅30%的恶性黑色素瘤细胞与单克隆抗体BB-1出现轻度结合；Chen等以CTL-4 1g作为探针检测了多株小鼠肿瘤细胞表面B7分子的表达，结果表明，在他们所检测的黑色素瘤、成纤维肉瘤、T 淋巴细胞瘤及肥大细胞瘤等细胞表面均不表达B7分子。他们根据双信号学说，以逆转录病毒为载体，将人类乳头状瘤病毒的ET基因转染小鼠黑色素瘤细胞株K1735，以期通过E7基因的表达增强肿瘤细胞的免疫原性；再将B7基因转染该细胞株以增强肿瘤细胞所缺乏的共刺激信号。将其接种小鼠后对其致瘤性的观察表明，单纯转染了E7基因的肿瘤细胞在体内完全失去了致瘤能力。Chen等将B7基因导入多种免疫原性不同的肿瘤细胞中后所进行的研究表明，无免疫原性的肿瘤细胞即使表达B7分子也不能诱导机体产生有效的免疫反应，也说明第一信号的必要性。他们还进一步探讨了B7基因及E7基因共转染的肿瘤细胞的抗肿瘤作用。发现，E7及B7基因共转染的K1375细胞的生长，而且能部分治愈于治疗前4天通过尾静脉接种了一定数量仅转染E7基因的K1375肿瘤细胞的实验性肺转移小鼠。人们将IL-4，IL-7，MHCI类分子等的基因与共刺激分子基因共转染肿瘤细胞后也取得了类似结果。美国NIH已批准将B7基因转染的肿瘤细胞制备的新型瘤苗试用于临床。

 

      另外，研究证实：向肺癌细胞导入主要组织相容性复合体Ⅰ-类基因(MHC-Ⅰ)能增强免疫原性，并被肿瘤特异性细胞毒淋巴细胞(CTL)所杀伤，同时MHC-Ⅰ的表达能降低成瘤性。

 

      2.转染效应细胞(TIL)的免疫基因治疗：研究表明：对TIL细胞做必要的修饰之后，能在很大程度上增强它的杀伤力，常用于插入TIL细胞的基因主要为IL-2，IL-6，IFN-γ，TNF等细胞因子基因。先将肺癌细胞取出，于存在IL-2的条件下培养以筛选TIL细胞，用重组有上述基因的RV转染TIL细胞，经此修饰的TIL细胞回输到患者肿瘤组织中去后便能表达IL-2，IL-6，IFN-γ，TNF等以提高机体对肿瘤的免疫能力。美国学者Hoffmann与哈尔滨医科大学联合进行临床试验，将RV介导IL-2基因插入的TIL细胞注入患者胸腔，治疗恶性胸腔积液，结果证实该方法的安全性并有一定的疗效。

 

      肺部肿瘤的自杀基因治疗

 

      一、自杀基因概述

     人们常将正常细胞在发育过程中的程序性死亡也即细胞凋亡形象地称为细胞自杀。为了深入研究细胞自杀的机制及意义，很多学者对执行和控制细胞“自杀”程序的基因进行了研究。人们发现和克隆了一些执行细胞“自杀”程序的基因如白细胞介素-1β(IL-1β)转化酶(ICE)基因等；也发现了一些阻止细胞“自杀”的基因如癌基因bcl-2等。随着对细胞自杀机制研究的深入，人们发现，一些来自病毒或细菌的基因具有一些特殊的功能，其表达产物可将原先对哺乳动物细胞无毒或极低毒性的药物转换成毒性产物，导致这些细胞的死亡。人们利用这一特点，将这类基因转移至靶细胞，使之对某些药物具有特别的敏感性，可以利用这些药物使靶细胞“自杀”。这类基因即称为“自杀基因”。由于“自杀基因”表达的产物多市能将无毒性前体药物代谢为毒性产物的酶，故又称为“前药转换酶基因”。根据细胞自杀机制，将“自杀基因”作为治疗性目的基因应用于肿瘤治疗的研究称为肿瘤的“自杀基因”疗法。指的是一类编码能将一些常规使用、对全身毒副作用小的药物转变为具有抗肿瘤作用、毒性作用较大的代谢产物的酶的基因。自杀基因主要有：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(ＨＳＫ－ＴＫ)和细菌胞嘧啶脱氨酶基因。目前研究最多的为ＨＳＫ－ＴＫ基因，其作用原理为：将ＨＳＫ－ＴＫ基因通过反转录病毒载体导入肺癌细胞中，TK基因表达产物能使没有细胞毒性的环核苷丙氧鸟苷(GCV)活化，活化后的GCV能抑制DNA合成，从而特异性杀伤肺癌细胞。与ＨＳＫ－ＴＫ基因作用类似，细菌胞嘧啶脱氨酶基因表达产物，能将5-氟胞嘧啶转化为具有细胞毒和抗代谢活性的5-氟尿嘧啶，从而特异性杀伤肿瘤细胞。

 

      Osaki等构建了以CEA启动子作为TK基因顺式调控序列的质粒，分别转染高水平分泌CEA的人肺腺癌细胞株A549，不分泌CEA的人肺癌细胞系CADO-LC9和Hela细胞，在体外测得GCV对细胞的50%生长抑制率(IC50)，在转染了TK基因的A549细胞为0.57μM，而未转染了TK基因的A549为600μM；CADO-LC9细胞不论转染与否，均为200μM；Hela细胞在转染了TK基因后IC50为58.3μM，未转染的细胞为213.3μM。转染后的A549细胞致瘤性没有明显下降，合用GCV后，肿瘤生长明显受抑，但GCV对其余各组的肿瘤生长无明显影响。非小细胞肺癌是呼吸道上皮来源的肿瘤，表面蛋白Ａ(ＳＰＡ)是呼吸道上皮分化的一个标志，Ｓｍｉｔｈ等构建了用ＳＰＡ－Ｉ的基因控序列或ＳＶ４０启动子作为ＨＳＫ－ＴＫ基因的启动子的质粒，分别转染人非小细胞肺癌细胞株Ｈ４４１和人肺腺癌细胞株Ａ４５９，以ＳＰＡ－Ｉ基因的调控序列调控的ＴＫ基因只能在Ｈ４４１细胞中表达，而ＳＶ４０启动子调控的ＴＫ基因在两株细胞均能表达。这两个实验表明对肺癌进行特异的自杀基因治疗是可行的。

 

      基因治疗作为一中崭新的治疗手段，为肺癌的攻克带来了资望，但目前还存在一些问题：

 

      1.缺乏理想的基因载体：理想的基因载体是能将遗传物质安全、高效地转移，并且定点整合到细胞基因组中，在细胞中长期稳定、特异表达或按一定要求调控表达，而且应用方便。目前的载体距离理想载体还有很大差距。

 

      2.难以寻找新的有效目的基因和加强目的基因的功能：肺癌是多基因疾病，这家大了寻找有效目的基因的难度。虽然肺癌的发生是多基因、多阶段的演变过程，但越来越多的证据表明某一关键基因的纠正确实能有效地抑制人肺癌细胞的成瘤性，特别是当该基因的纠正将使凋亡途径的活性上调。因此，新的有效基因，其表达应该是既呢功能抑制、杀伤肿瘤细胞，又能诱导其凋亡。

 

      3.联合治疗的前景：联合治疗包括基因治疗与放疗或化疗间的联合，不同基因治疗策略间的联合等。最新研究成果表明，对NSCLC患者进行基因治疗结合放疗或化疗；对肺癌肝转移患者行腺病毒介导的自杀基因联合细胞因子几治疗均取得较为满意的疗效，可见联合治疗有着极为广阔的前景。

 

      可以肯定，随着对肺癌发生分子机制认识的加深和基因工程技术的发展，肺癌基因治疗不久将会有重大突破，并可能成为本世纪肺癌治疗的主要手段之一。